به مدت ۹۰ ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و ۵ دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.
۵- مخلوط فوق را به ۹۰۰ میکرولیتر از محیط LB فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت ۵/۱ ساعت در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
۶- مخلوط فوق را به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۷- ۸۰۰ میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در ۲۳۰ میکرولیتر باقی مانده ، به خوبی حل می کنیم.
۸- ۲۳۰ میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آنها را به مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری می کنیم.
۳-۵-۴ ارزیابی کلونی ها
پس از انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود ۱ تا ۲ میلی متر می رسد. یک تک کلونی را جدا کرده و در ۵ میلی متر LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در ۳۷ درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری BL21(DE3) پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
۳-۵-۵ استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن CD166
جهت تایید وجود پلاسمید بیانی pet-28a در باکتری و عدم وجود هر گونه آلودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید موردنظر تایید شود ، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت. مراحل انجام کار به صورت زیر است :
۱- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، ۵/۱ میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب ۵/۱ می ریزیم.
۲- سپس به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۳- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته : برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.
۴- در این مرحله ۲۵۰ میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
۵- ۲۵۰ میکرولیتر از محلول لیز کننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را ۴ تا ۶ بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
۶- در مرحله ی بعد ۳۵۰ میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم. سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سروته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
۷- سپس به مدت ۵ دقیقه در ۹۰۰۰ دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
۸- محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
۹- محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم. این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
۱۰- ستون حاوی محلول را به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۱۱- محلول روئی را دور می ریزیم.
۱۲- به ستون ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم.
۱۳- به مدت ۴۵ ثانیه در ۱۲۰۰۰ دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم.
۱۴- مرحله قبل را یکبار دیگر تکرار می کنیم.
۱۵- محلول درون ستون را دور می ریزیم.
۱۶- ستون را به مدت ۱ دقیقه دیگر در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیر الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
۱۷- ستون را درون یک میکروتیوب ۵/۱ قرار می دهیم و سپس بافر جداکننده را به میزان ۵۰ میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم. بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. ۲ الی ۳ دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
۱۸- به مدت ۲ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور ستون را در درون میکروتیوب ۵/۱ سانتریفیوژ می کنیم.
۱۹- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
۳-۵-۶ تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید pet-28a که حاوی ژن CD166 انتقال داده شده به آن به کمک تکنیک لایگیشن است و تایید وجود آن ، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن CD166 می توان از آنها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز بوده تا قطعات موردنظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
۳-۵-۶-۱ هضم آنزیمی دوگانه و الکتروفورز
مراحل انجام کار به شکل زیر است :
۱- یک میکروتیوب ۲/۰ برمی داریم و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم.
• آب استریل : ۱۲ میکرولیتر
• بافر تنگو ۲x : 4 میکرولیتر
• آنزیم Ncol : 1 میکرولیتر
• آنزیم Xhol : 1 میکرولیتر
• پلاسمید pet-28a نوترکیب : ۲ میکرولیتر
حجم نهایی واکنش : ۲۰ میکرولیتر
۲- میکروتیوب را به مدت ۱ الی ۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد (دمای اپمتیوم واکنش آنزیم ها) قرار می دهیم.
۳- الکتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسمید و ژن CD166 شناسایی و تایید شوند.
۳-۶ بیان پروتئین CD 166
پس از تایید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن CD166 در باکتری میزبان ، با توجه به پروموتر lac در پلاسمید pet-28a ، جهت القاء بیان پروتئین در باکتری از القاگر IPTG در رقت مناسب استفاده شد.
۳-۶-۱ القاء بیان پروتئین ب
ه کمک IPTG
مراحل کار بصورت زیر می باشد :
۱) به ۲ میلی لیتر از محیط کشت LB حاوی آنتی بیوتیک کانامایسین ، ۲۰ لاندا از باکتری BL21(DE3) ترانسفورم شده اضافه شد و به مدت یک شب در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد و با سرعت rpm 150 قرار داده شد و به آن اجازه دادیم تا رشد کند.
۲) ۲۰ لاندا از مخلوط موردنظر به ۲ میلی لیتر از محیط کشت LB تازه حاوی انتی بیوتیک کانامایسین اضافه شد و به مدت ۲ ساعت در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد با rpm 150 قرار داده شد تا غلظت باکتری موردنظر به OD به ۸/۰ برسد. بدین طریق باکتری ها تازه گشته و در فاز لگاریتمی خود قرار دارند.
۳) ۲۰ لاندا از القاگر IPTG با غلظت ۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر به ۲ میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده اضافه شد و سپس به مدت ۶ ساعت در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد با سرعت rpm 150 قرار داده شد.
نکته : نمونه های کنترل منفی بدون افزوده شدن IPTG مورد بررسی قرار گرفتند.
۴) مخلوط موردنظر به مدت ۵ دقیقه در ۴ درجه و با سرعت rpm 5000 سانتریفیوژ شد.
۵) محلول روئی را دور ریخته و به رسوب آن لاندا ۶۰ اوره ۸ مولار اضافه شد و به کمک تکنیک SDS-page بیان پروتئین موردنظر مورد بررسی قرار گرفت.
۶-۳-۲ بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page
به منظور جداسازی باندهای پروتئینی سلولی و ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین موردنظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل امید استفاده شد و عصاره های سلولی تهیه شده بر روی SDS-page الکتروفورز شدند. با توجه به این که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب حدود ۵/۵۳ کیلو دالتون می باشد از ژل ۱۲% استفاده شد. برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب از کیت ۸D8-page ساخت شرکت سیتومتین ژن اصفهان استفاده شد.
۳-۶-۲-۱ محتویات کیت ۸D8-page
۱. محلول ذخیره آکریل امید و بیس آکریل امید ۴۰% : ۴۰ میلی لیتر
۲. محلول بافر Running 10X : 25 میلی لیتر
۳. محلول بافر Stacking 10X : 10 میلی لیتر
۴. پودر محلول ذخیره SDS 10% : 5 میلی لیتر
۵. پودر محلول ۱۰% آمونیوم پرسولفات (APS) : 5 میلی لیتر
۶. پودر بافر Tank 10X : 400 میلی لیتر
۷. محلول بافر ۲X SDS gel loading : 2 میلی لیتر
۸. محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو : ۳۰۰ میلی لیتر
۹. محلول رنگ بر کوماسی بلو : ۴۰۰ میلی لیتر
۱۰. محلول TEMED : 1 میلی لیتر
مواردی که موردنیاز است ولی در کیت موجود نیست : اتانول ، مارکر پروتئین
۳-۶-۲-۲ آماده سازی و توضیحات مربوط به محتویات کیت :
۱) آکریل امید ۴۰%
این محلول باید در ظرف تیره و در دمای اتاق نگه داری شود زیرا نور و شرایط قلیایی باعث تسریع واکنش تبدیل آکریل امید و بیس آکریل امید به آکریلیک اسید و بیس آکریلیک اسید می شود.
۲) بافر Running 10X
از این بافر برای تهیه ژل Running استفاده می شود.

متن کامل در سایت سبز فایل


دیدگاهتان را بنویسید